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現代生物技術綜合實訓 版權信息
- ISBN：9787511127402
- 條形碼：9787511127402 ; 978-7-5111-2740-2
- 裝幀：暫無
- 冊數：暫無
- 重量：暫無
- 所屬分類：>
現代生物技術綜合實訓 內容簡介
《現代生物技術綜合實訓》以基因工程、蛋白工程實驗為基礎，組成了生物工程中上游和下游技術。以綠色熒光蛋白的克隆、轉化和原核表達作為一個整體實驗，放棄了原先實訓模式中單獨小實驗的結構，而改為一個獨立的大實驗，增強了學生的設計能力和主動性。這些實驗既注重和加強了原來各自的實驗內容，又注意到相互聯系。 《現代生物技術綜合實訓》內容分為兩個模塊：*一模塊包括基因工程的基本理論以及相應的實踐操作；第二模塊包括蛋白質工程的基本技術和實用技能綜合性實驗。這些實驗采取大實驗方法，使學生有一個完整的操作過程，對理解生物工程的上游、中游和下游技術有了感性認識。
現代生物技術綜合實訓 目錄
模塊一 基因工程
項目一 質粒DNA的抽提
項目二 瓊脂糖凝膠電泳
項目三 PCR擴增
項目四 DNA片段的回收及純化
項目五 大腸桿菌化學感受態的制備及轉化
項目六 外源DNA片段的定向克隆
模塊二 蛋白質工程
項目一 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
項目二 外源基因在大腸桿菌中的表達
項目一 質粒DNA的抽提
項目二 瓊脂糖凝膠電泳
項目三 PCR擴增
項目四 DNA片段的回收及純化
項目五 大腸桿菌化學感受態的制備及轉化
項目六 外源DNA片段的定向克隆
模塊二 蛋白質工程
項目一 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
項目二 外源基因在大腸桿菌中的表達
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現代生物技術綜合實訓 節選
《現代生物技術綜合實訓》： 質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取是*常用、*基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包括3個主要步驟：細菌的培養、細菌的收集和裂解、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒的抽提過程。 一、實驗目的 了解堿裂解法制備質粒的原理，掌握質粒小抽的傳統方法和商業化柱層析方法。 二、實驗原理 從細菌（如大腸桿菌或枯草桿菌）中提取DNA的方法很多，其分離原理可根據.DNA分子大小的不同、堿基組成的差異以及質粒DNA的超螺旋共價閉合環狀結構的特點來進行。目前常用的有堿變性法、酸酚法、PEG法、煮沸法以及溴化乙錠一氯化銫梯度離心法。這些方法各有利弊，有的操作煩瑣，難以控制，有的純度不夠，有的需要昂貴的儀器。而堿變性法被認為是一種既經濟，且DNA收得率又高的被普遍采用的提取方法。用這種方法提取的DNA可用于酶切、連接和轉化。 堿變性法提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離的目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環結構的兩條互補鏈不能完全分離，當以pH為4.8的NaAC緩沖液調節其pH至中性時，變性的質粒.DNA又恢復到原來的構型，保存于溶液中，而染色體DNA不能復性，形成纏連的網狀結構，通過離心與不穩定的大分子RNA、蛋白.SDS復合物等一起沉淀下來而去除，從而達到分離的目的。后面可以采用傳統的酚+氯仿抽提，酸性、低離子強度時超螺旋DNA在水相中，開環、線型分子在酚相中進行分離的酸酚法；利用商業化DNA結合柱只吸附DNA進行分離純化。 （一）裂解細胞 裂解細胞是指通過溶菌酶、去污劑等試劑破裂細胞壁與膜的過程。對于不同的菌要選用不同的方法，通常有煮沸法、非離子型去污劑法、堿性SDS法（簡稱堿法）等。三種方法比較而言，非離子型去污劑法較溫和，適用于抽提10kb左右的質粒；而煮沸法與堿性SDS法相對較劇烈，只能抽提小于10kb的質粒。常用的離子型去污劑是SDS、非離子型去污劑有Tritonx-100等。 （二）分離 將質粒DNA和細菌染色體DNA進行分離。堿裂解法的分離原理如下：大腸桿菌的染色體約有4700kb長，在處理細胞過程中都斷裂成不同長度的雙鏈DNA片段。在pH高達12的堿性條件下，雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA的雙鏈分離成單鏈；而呈超螺旋狀態的質粒DNA僅僅是氫鍵被破壞，并只發生部分雙鏈解離成單鏈的變化。再當pH調回中性時，單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質結合生成網絡狀大分子，而超螺旋的質粒發生復性反應后仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達到分離的目的。 （三）純化 細胞裂解液中的雜質除了染色體DNA外還有各種細胞壁、膜碎片、蛋白質、脂質類物質及RNA。純化的步驟就是有針對性地將它們去除，RNA可用。RNaseA消化。其他雜質可用傳統的采酚一氯仿方法抽提除去，殘余的蛋白質可通過酚、酚.氯仿、氯仿一異戊醇，使蛋白質變性而除去，同時，氯仿有強烈的溶脂傾向，對于在除去蛋白質的同時去除脂質類雜質很有好處。氯仿還能將微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉，而微量的酚對于以后的酶切、轉化等過程都會產生不利影響。氯仿／異戊醇的蛋白質變性能力較弱，主要用于含酚試劑處理后的抽提。除了傳統方法，現代生物技術發展，各種質粒小抽商業化試劑盒出現，使用DNA.的結合柱結合質粒DNA，同時去除雜質，*終獲得純化高的質粒DNA。 ……
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