試驗設計與數據分析——從宏觀到微觀 節選

**篇試驗設計原則及案例分析 **章試驗設計概述 在20世紀20年代至40年代初，英國科學家費希爾（R.A.Fisher）運用拉丁方設計解決了長期未能解決的試驗條件不均勻問題，并將這一方法應用于農業生產。隨后，英、美、蘇等工業化國家將試驗設計及其分析方法推廣到工業領域。日本統計學家田口玄一博士于1949年創造了正交試驗設計方法。我國學者王元、方開泰等于1978年創立了均勻試驗設計方法。目前，試驗設計作為相對獨立的一門學科，正在生物、醫藥、農業、工業等領域發揮越來越大的作用。 **節生物學試驗設計的特點、基本要素與注意事項 一、生物學試驗設計的特點 生物是有生命的，存在節律特性，以及取食、生長、代謝、發育、繁殖等生理活動，受環境影響較大。因此，控制非處理因素很重要。 生物學試驗設計的主要特點包括以下幾點。 （1）試驗材料個體差異較大。一般來說，獲取純合一致的試驗材料不易，有時（如大動物）甚至很困難。因此，常常需要利用局部控制原則，對非處理因素進行局部控制，隨機區組設計是常用的試驗設計方法。 （2）取樣時間很關鍵。因為生物常常具有特定的節律性，因此取樣時間不僅要固定在一天的某個時間，而且取樣時間要有針對性（針對所研究的問題）。在岡比亞按蚊中，至少有2000個以上的基因具有節律性表達特性。一些農藥在每天不同時間點具有不同的殺蟲效率，例如，吡蟲啉在中午12：00對褐飛虱的防治效果比下午16：00高約20%，敵蠅威對蟑螂的毒性在夜間相對較大。又如，在分析食物消耗和大鼠活動的數據之后發現，作為夜行生物的大鼠進食大部分是在黑暗的時候，在晚上11點～早上5點這個時間段中，大鼠的食物消耗變動很少，因此在研究食物對大鼠某些指標的影響時，在凌晨4點左右取樣較好。 （3）經常需要利用突變體材料作為對照，特別是研究基因功能時。一種方法是通過基因敲除或過表達獲得突變體（然后測定各種生物學參數或指標），另一種方法是篩選自然變異材料。 （4）需要設置稍多的重復數。在試驗過程中，有時會出現生物發育不正常甚至死亡等現象，因此在實際操作時通常需要設置稍多的重復數，以確保有足夠的有效重復數，以便獲得可靠的觀測指標值。 （5）試驗周期較長。有些生物（如酵母、大腸桿菌、果蠅等）世代發育時間較短，因此作為試驗材料有一定的優勢。有些生物（如楊樹）的生長期很長，獲得試驗數據的難度就較大。 二、試驗設計的基本要素 試驗設計的基本要素包括試驗因素、試驗單元和試驗效應。 1.試驗因素 試驗因素簡稱為因素或因子，是試驗中所研究的影響試驗效應的原因或原因組合，常用大寫英文字母表示。因素的具體取值稱為水平，可用A1、A2、A3等表示。確定因素水平的數量及具體數值需要專業知識，常常需要閱讀文獻來確定。在缺乏文獻時，可以先做預試驗。因素水平選取得過于密集，試驗次數就會增多，許多相鄰的水平對結果的影響十分接近，將會浪費人力、物力和時間，降低試驗的效率。 因素可分為固定因素（可控因素）和隨機因素（非可控因素）。例如，人為設置的溫度是固定因素，大麥中的水分是隨機因素。 2.試驗單元 試驗單元是試驗中能接受不同試驗處理的獨立的試驗載體，實際上就是根據研究目的而確定的觀測對象。例如，比較不同水稻品種的產量時，水稻是試驗單元；比較畢赤酵母處理前后的抑菌效果時，畢赤酵母是試驗單元；比較褐飛虱不同地理種群的抗藥性時，褐飛虱是試驗單元。 在醫學和生物學試驗中，試驗單元也稱為受試對象，選擇受試對象不僅要依照統計學原理，還要考慮到生理和倫理等問題。例如，在選擇動物為受試對象時，要考慮動物的種屬品系、窩別、性別、年齡、體重、健康狀況等。 3.試驗效應 試驗效應是試驗因素作用于試驗單元的反應，是研究結果的*終體現。觀察或獲取體現試驗效應的指標時，要特別注意隨機的重要性。例如用A1、A2、A3、A4和A5五種飼料飼喂家雞，一個月后稱重。如何體現稱重對象的隨機性就很重要，因為家雞存在代謝活動，人為的稱重早或稱重晚都會導致結果不正確。 而且，試驗效應要具體，不能模糊。例如，研究三種飼料對生豬增重的影響，其效應是增加的體重，很明確。又如，研究溫度對赤眼蜂的影響，試驗效應就不夠具體，到底是什么影響，沒有清晰說明。 三、生物學試驗設計的注意事項 制定生物學試驗計劃時，需要注意以下五點。 1.試驗目的要明確 試驗目的明確，就是要明確該試驗需要解決的科學問題。科學問題的重要性決定了試驗的價值。試驗目的常常通過具體的觀測指標來實現，因此觀測指標要具體，例如鑒定某個受體的配體。在研究生介紹研究計劃時，有時會出現觀測指標不明確的現象，例如研究某個條件對某種生物的影響。此外，該試驗是初篩還是詳細研究？也需要事先確定，因為初篩往往只設置1個重復，并且觀測指標少一些，而詳細研究則需要多個重復且有更多的觀測指標。 2.試驗材料要滿足要求 生物學試驗材料的獲取往往有一定難度。例如，保護性動物（如大熊貓）的樣品獲取需要仔細思考實施方案，獲取遺傳背景一致的大型養殖動物（如豬）比較困難。我們在制訂研究計劃時，需要根據試驗材料選取合適的試驗設計方案。 3.試驗條件要有代表性 試驗條件要能夠代表將來準備推廣該試驗結果的地區的生產、經濟和自然條件。只有這樣，試驗結果才能符合實際。例如，研究溫度對水稻生長的影響，該溫度梯度就不好：25℃、26℃、27℃、28℃、29℃，不僅因為不同溫度水平之間只相差1℃，試驗儀器的精度通常難以保證達到要求，而且溫度幅度太窄，缺乏代表性。 試驗條件的選取很重要。一般來說，我們可查閱文獻獲得一些基本信息，例如水稻生長的適合溫度通常在25～30℃，因此可以此區間為中點設計溫度梯度，如16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃。如果是原創性研究，沒有相關文獻可供借鑒，通常設置幅度較寬的水平梯度（如0℃、20℃、40℃、60℃、80℃、100℃），然后利用正交設計進行初篩，然后再進行詳細研究。 4.試驗結果要可靠 高度的責任心和科學的態度是保證試驗結果可靠性的必要條件。在試驗過程中，要嚴格按試驗要求和操作規程執行各技術環節，避免發生人為的錯誤和系統誤差，尤其要注意試驗條件的一致性，減少誤差，提高試驗結果的可靠性。一個試驗如果需要多人完成，要保證每人完成固定的步驟。試驗指標的測量如果有多臺儀器，盡量使用同一臺儀器進行測量。 為了保證試驗結果能夠重演，要對試驗過程進行詳細、完整、及時和準確的記錄，以便分析各種試驗結果產生的原因。 5.試驗設計方案要能反映預定試驗目的 在制訂試驗方案時，要確保能實現預定的試驗目的。在試驗過程中，對試驗方案進行優化或修改也很常見，這個階段也要緊盯*初的試驗目的。下面通過一個例子加以說明。 試驗目的：攝食足以引起肥胖的高脂肪的大鼠和正常飲食的大鼠相比，肝臟哪些基因的表達發生了變化？ 研究者*初的試驗設計方案如下。①試驗方法：成對試驗；②飼喂時間：利用高脂肪的飼料和正常飼料飼喂大鼠12h，然后取大鼠的肝臟用于轉錄組測序，取樣時間：早上7點，設10次重復；③利用轉錄組測序獲得差異表達基因。通過這一試驗方案，可獲得攝食高脂肪12h后大鼠肝臟中的差異表達基因。但是，與*初的試驗目的相比，兩者并不一致。因此，研究者應該思考原因，發現應該等到高脂肪飲食后大鼠變得肥胖再開始試驗。 在肥胖大鼠肝臟中，對于不同的表型“標記”，基因表達變化也會不同。這些“標記”有：體重的增加、對胰島素不敏感、肝酶的變化、脂肪肝等。在研究者的試驗中，利用2個月的體重增加量和對胰島素的不敏感度來定義“肥胖”。然后，研究這個階段的基因表達變化。因此，選擇一個清晰的“標記”或標準來定義相關的結果，可以保證采用的試驗方案能夠反映預定試驗目的。*終的試驗設計方案如下：①10只大鼠飼喂正常飼料，10只大鼠飼喂高脂肪飼料，即重復10次；②每組中的大鼠按年齡、性別和起始體重配對；③每周測量大鼠體重和血清化學參數。當大鼠呈現肥胖和胰島素不敏感時，取出大鼠肝臟用于轉錄組測序；④取樣時間：凌晨4：30（詳見本節生物學試驗設計的特點）；⑤分析差異表達基因并進行驗證。 第二節試驗設計的基本原則 試驗設計的總目標是用較少的人力、物力和時間獲得盡可能多且可靠的數據資料。因此，需要考慮人力、物力和時間等需求，觀測指標具體且做了合理安排，重要的非處理因素都得到了有效的控制。對試驗的操作方法、試驗數據的收集、整理、分析方式都已經確定了科學合理的方法。此外，試驗中可能出現的各種意外情況都已考慮在內并有相應的對策。從涉及的統計要求看，一個完善的試驗設計方案應該明確試驗因素、試驗單元和試驗效應，并充分體現隨機、重復、對照和局部控制四個基本原則。 一、隨機化原則 隨機化是指每個處理以概率均等的原則，隨機地選擇試驗單元。例如用A1、A2、A3、A4和A5五種飼料飼喂家雞，每種飼料30只雞。在實際分組時可以采用抽簽的方式，把150只家雞按任意的順序編為1～150號，用外形相同的紙條寫出1～150個號碼，從中隨機抽取30個號碼，對應的30只雞分配給A1組，類似地可完成其他組的動物分配。一個月后稱重時也要體現隨機化原則。如果每只雞是單獨飼養的，可通過產生隨機數的方式抓取對應編號的雞稱重。如果各組的30只雞是混合飼養的，可采取分層隨機的方式。首先在1～5之間產生一個隨機數（假設是3），然后在A3組中隨機抓取1只雞稱重；接下來再產生一個隨機數（假設是2，如仍是3則重新產生），在A2組中隨機抓取1只雞稱重，依此可完成一個循環：在五組中各隨機抓取1只雞稱重。重復這個循環即可完成其他動物的稱重。 如果違背隨機的原則，不論是有意或無意的，都會影響試驗結果的正確性，給試驗結果帶來偏差。如果我們在上述稱重過程中，按A1至A5的順序依次稱重（首先稱重A1組的30只，*后稱重A5組的30只），則會人為導致A5組的動物體重偏低等偏差，因為動物的消化等生理活動導致一段時間后的體重會相對低一些。隨機化試驗就是避免此類偏差的有效手段。 隨機化原則的另外一個作用是有利于應用各種統計分析方法，因為統計學中的很多方法都是建立在獨立樣本的基礎上的，用隨機化原則設計和實施的試驗就可以保證試驗數據的獨立性。 二、重復原則 重復是指在試驗中，將一個處理實施在2個或2個以上的試驗單元上。在相同的處理條件下對不同的試驗單元做多次試驗，這是人們通常意義下所指的獨立重復試驗。通過重復，可以計算試驗誤差，可以從統計學上對處理的效應給以肯定或予以否定。 從統計學的觀點看，重復數越多試驗結果的可信度就越高，但是這就需要花費更多的人力、物力和時間。因此，重復數的多少，應根據試驗的要求和條件來確定。如果是初篩試驗，可以只做一個重復（n=1），找到比較可能的條件后再增加重復數。如果試驗效應值的方差較大，一般需增加重復數。有些試驗由于其重要性（例如開發人類某種疾病的診斷方法），通常需要較多重復數。此外，發表論文時，不同的刊物對試驗重復數的要求也不盡相同。在獲得部分試驗數據后，利用R語言的pwr包可以估算在某一概率條件下獲得顯著差異試驗結果所需要的重復數。 針對重復數，是否有一個客觀的標準呢？答案是肯定的。這時，我們需要實施的試驗重復數（m）要大于*少重復數（n），即m>n。然后我們對m個重復的試驗結果數據進行子集分析，即每次任意減少一個重復的數據，然后比較任何一個更小的數據組能否得出與m個數據組相同的結果，直至不能減少為止。這樣，*后那個與m個數據組的結果相同的數據組的重復數即為*少重復數。也就是說，要獲得*少重復數通常需要做更多的試驗，因此這種方法不常用。